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Prix des ingénieurs de l'Année

Pour la science : Bernard Chalmond et Spencer Shorte



Ils font tourner la tête des cellules
Avec leur équipe de l'Institut Pasteur et de l'ENS Cachan, ils ont modifié un trieur pour piéger les cellules une à une et les faire tourner devant l'objectif du microscope. Résultat: une analyse directe en 3D.








Faire tourner devant l'objectif une cellule humaine en suspension grâce à un joystick coloré, pour la regarder sous toutes les coutures... Serait-ce la blague d'un chercheur potache ? Pas du tout. Une équipe de près d'une vingtaine de chercheurs travaillent sur ce projet, aux Etats-Unis et en Europe, avec en France l'Institut Pasteur et l'ENS (Ecole normale supérieure) de Cachan. «Cette technique d'imagerie permet d'étudier, dans des conditions physiologiques, des cellules non adhérentes en trois dimensions », explique l'initiateur du projet, Spencer Shorte, directeur de la plate-forme d'imagerie dynamique et de l'Imagopole, à l'Institut Pasteur.Recherche de nouveaux médicaments, criblage haut débit ou encore diagnostic, les applications ne manquent pas.

«Le système automatisé pourrait devenir un outil de diagnostic clinique sur des cellules humaines isolées, ou bien un outil de tests de criblage préclinique sur des cellules modèles non adhérentes marquées par fluorescence», explique Olivier Renaud, biologiste dans l'équipe de Spencer Shorte. Par exemple, grâce à un marquage par fluorescence du virus du sida, le chercheur peut regarder si le virus réussit à entrer dans le noyau de cellules préalablement traitées par un médicament. Voilà donc une avancée importante dans l'imagerie 3D des cellules. En effet, pour obtenir une haute résolution, les systèmes classiques exigent des cellules immobilisées sur un support, ce qui est très difficile à réaliser pour des cellules circulantes comme les cellules sanguines. De plus, des artéfacts existent obligatoirement car l'objectif se déplace selon un axe pour acquérir les images.


Une rotation de 360 degrés autour d'un plan focal fixe
Mais comment induire la rotation de cellules devant un objectif ?
Spencer Shorte en a eu l'idée alors qu'il utilisait le trieur de cellules de l'entreprise allemande Evotec. Ce microsystème permet de charger les cellules en solution dans des microcanaux. Elles se rangent les unes derrière les autres et arrivent dans une cage diélectrophorétique. Ce piège est constitué de huit électrodes photolithographiées sur des lamelles de verre, qui ont une action sur les cellules vivantes puisque celles-ci portent des charges électriques. Ces cellules sont maintenues devant l'objectif pendant moins d'une seconde, le temps que l'utilisateur regarde leur morphologie ou bien un type de fluorescence. Une fois la cellule analysée, la cage est désactivée d'un côté (changement de champ électrique) et la cellule est propulsée vers le microcanal qui lui correspond.

C'est au moment de l'immobilisation de la cellule que les chercheurs français ont modifié le processus. Ils ont agi finement sur chaque électrode pendant l'immobilisation de la cellule dans la cage, pour induire une rotation contrôlée de 360 degrés autour d'un plan focal fixe. «Chaque électrode possède un courant alternatif. En décalant la fréquence et l'amplitude de ce courant, on induit un changement de l'effet diélectrique sur l'objet piégé, ce qui entraîne son mouvement », explique Spencer Shorte. Pour protéger l'invention, un brevet européen a été déposé conjointement par l'Institut Pasteur et Evotec sur ce système d'imagerie par rotation.


La possibilité d'étudier des cellules circulantes
C'est la première fois qu'un système atteint une telle précision et permet d'analyser en 3D des cellules circulantes. L'équipe a démontré la puissance de cet outil en visualisant un globule rouge humain vivant infecté par le parasite de la malaria, parasite marqué par fluorescence. La rotation a permis de dénombrer quatre parasites présents là où l'observation en plan unique n'en montrait que deux. Et pourtant, Spencer Shorte a douté de la faisabilité de sa nouvelle technique d'imagerie. En cause notamment : la vitesse d'acquisition des images par la caméra. Aucune solution ne voyait le jour, jusqu'au moment où une société d'Irlande du Nord a présenté une caméra de haute sensibilité avec la technologie EMCCD. «Cela a accéléré d'un coup le projet», raconte Spencer Shorte, qui a tout de suite intégré cette caméra dans son système. Autre accélérateur du projet, sa rencontre avec Bernard Chalmond, mathématicien.

Depuis trois ans et demi, celui-ci s'occupe du développement informatique extrêmement complexe. « Les difficultés sont énormes. Quand la cellule tourne, sa trajectoire n'est pas stable donc la position exacte des coupes n'est pas connue. Il faut à la fois déterminer cette position et réaliser la reconstitution 3D. Celle-ci rendra possible la quantification », raconte Bernard Chalmond. Ce projet est financé depuis début 2005, dans le cadre du programme Nest du sixième PCRD européen, à hauteur de 1,5 million d'euros sur trois ans et est intitulé «Automation». L'objectif : construire pour la fin 2007 un prototype entièrement automatisé pour des criblages à haut débit. Toutes les étapes, du piégeage des cellules à l'acquisition d'images seront alors automatisées.


L'INNOVATION



UN AUTOMATE D'ANALYSE 3D DE CELLULES VIVANTES NON ADHÉRENTES
Diagnostic clinique, tests de criblage de médicament en préclinique ou tout simplement analyse morphologique des cellules non adhérentes (cellules souches, embryons ou encore cellules sanguines...) en conditions physiologiques. Les applications du système d'analyse directe en 3D élaboré par les équipes de Spencer Shorte et Bernard Chalmond sont multiples. En partant d'un système de tri cellulaire de la société allemande Evotec Technologies, les chercheurs ont utilisé la cage diélectrophorétique qui piège les cellules entre des électrodes pour les faire entrer en rotation. Les cellules entrent dans des microcanaux et arrivent une à une dans le champ diélectrophorétique, elles sont alors immobilisées en suspension.

Les chercheurs ont allongé les câbles reliés à chacune des huit électrodes de la cage pour contrôler le mouvement de l'objet piégé. Lorsqu'ils changent la fréquence et l'amplitude du signal alternatif d'une électrode, la cellule pivote autour d'un plan focal donné. Ils peuvent ainsi visualiser sa morphologie directement en 3D en lumière transmise, ou bien en observant la fluorescence émise. Ce système de microrotation, qui s'adapte à tous les types de microscopes, a fait l'objet d'un cobrevet avec la société allemande et est commercialisé. Actuellement, les chercheurs poursuivent l'automatisation de l'ensemble du système, au sein d'un projet européen.



LEUR PARCOURS

SPENCER SHORTE, 39 ans, directeur de la plate-forme d'imagerie dynamique et de l'Imagopole à l'Institut Pasteur, docteur en biochimie de l'université de Bristol, assistant-professeur aux Etats-Unis. Il a rejoint l'Institut Pasteur en 2001, attiré par la création d'un pôle technologique novateur dédié à l'imagerie.

BERNARD CHALMOND, 54 ans, chercheur à l'Ecole normale supérieure de Cachan, docteur en mathématiques de l'université d'Orsay. Il a toujours privilégié les interactions entre recherches fondamentale et appliquée. Il a ainsi développé des logiciels de conception sur mesure de prothèses et créé un bureau d'études sur les composants logiciels.

LEUR ÉQUIPE
Evidemment un tel projet ne peut être mené à bien que par une équipe multidisciplinaire. A l'Institut Pasteur, elle est composée de deux biologistes avec des compétences en imagerie, un biophysicien, cinq ingénieurs spécialisés en microscopie et en imagerie dynamique et un ingénieur informaticien. Sans oublier l'équipe de l'ENS de Cachan, avec ses trois ingénieurs de recherche en mathématique et informatique et ses deux enseignants-chercheurs, qui développe les algorithmes afin de réaliser la tomographie tridimensionnelle par fluorescence. Le défi de tout ce petit monde? Se comprendre ! Pas si simple en venant d'horizons très différents.


ILS ONT AUSSI ÉTÉ NOMINÉS...

ALAIN SOUFFLOT, 62 ans, chef de projets spatiaux à l'ESA, ingénieur de l'Ecole française de radioélectricité et d'électronique.
L'innovation : une microcaméra a été développée pour assurer la production d'images de haute qualité d'une comète, point clé de la mission spatiale Rosetta. Ce dispositif a été lancé l'année dernière par une fusée Ariane et atteindra la comète visée en 2014.

FABIEN MALBET, 38 ans, chargé de recherche au CNRS, responsable scientifique du projet Amber, docteur en strophysique.
L'innovation : l'interféromètre Amber permet de mélanger la lumière provenant de plusieurs télescopes de 8mètres du VLT (Very Large Telescope). Du coup, l'instrument équivaut à un miroir de 200 mètres de diamètre ! De quoi étudier les planètes extrasolaires.

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