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La protéomique trouve les bonnes cibles thérapeutiques

Après la génomique voici l'étude systématique des protéines. Elle permet la découverte de marqueurs de maladies et de cibles thérapeutiques.


En 1995, lorsque le post-doctorant australien Marc Wilkins parle pour la première fois de protéome (comme l'ensemble des protéines d'une cellule), il ne se doute pas qu'il introduit une toute nouvelle science.
Pourtant, la protéomique est aujourd'hui considérée comme le chantier le plus prometteur des biotechnologies. Et ce, au moment où le décryptage du génome humain est, lui, quasiment bouclé.

 " La protéomique représente l'étude du produit fini de l'expression d'un gène, à savoir la protéine ", explique Jérôme Garin, directeur du laboratoire de chimie des protéines du CEA à Grenoble.

Marqueurs de maladies
Cette discipline consiste à quantifier et identifier l'ensemble des protéines d'une cellule dans un environnement donné. En comparant les protéines d'échantillons sains et malades, on peut déduire celles qui sont spécifiques d'une pathologie. Ces protéines deviennent alors des marqueurs de la maladie en question, base de nouveaux diagnostics. Mais ce sont aussi des cibles potentielles pour de futurs médicaments contre cette pathologie.

 Un intérêt qui n'a pas échappé à Craig Venter, célèbre patron de Celera Genomics (qui avait dévoilé fin juin 2000 "son" décryptage du génome humain). En association avec l'Institut suisse de bio-informatique, il affiche ses ambitions : identifier tout le protéome humain, soit plus d'un million de protéines différentes !

L'une des premières entreprises de biotechnologies à avoir développé le concept de protéomique est le britannique Oxford GlycoSciences (voir I & T n°805). D'abord en partenariat avec l'université d'Oxford : une cinquantaine de protéines spécifiques de cancers ont ainsi été découvertes. Puis, avec les plus grands groupes pharmaceutiques.
Au programme, depuis 1998 : la recherche de protéines spécifiques de la maladie d'Alzheimer et de l'athérosclérose (avec Pfizer), de l'asthme et autres maladies pulmonaires (avec Bayer), du diabète (avec Merck) et de cancers (avec Incyte).

SITES WEB
Amersham Pharmacia Biotech
Bio-Rad
Bruker
Ciphergen
Genomic Solutions
Hybrigenics
Micromass
Oxford GlycoSciences
Proteome
À noter qu'OGS développe aussi la protéomique végétale. Son partenariat avec Pioneer Hi-Bred (groupe Du Pont de Nemours) vise à identifier des protéines associées à la croissance des cultures, en particulier le maïs.

Identifier des centaines de protéines par jour
La protéomique repose principalement sur deux techniques d'analyse : l'électrophorèse bidimensionnelle et la spectrométrie de masse. L'électrophorèse 2D sur gel sépare les protéines d'un mélange en solution en fonction de leur charge électrique et de leur masse moléculaire. Au final, chaque tache visualisée sur le gel (par coloration ou marquage radioactif, fluorescent...) contient une protéine différente. " Plus de mille protéines peuvent ainsi être analysées sur un gel d'électrophorèse 2D ", précise Jérôme Garin, du CEA à Grenoble.

Une fois séparées, les protéines sont identifiées par spectrométrie de masse. Cette technique accélère sérieusement la tâche des chercheurs. Auparavant, ils identifiaient une ou deux protéines par jour, par séquençage par voie chimique (la méthode Edman). Grâce à un spectromètre de masse de type Maldi TOF (Matrix assisted laser desorption-Time of flight), ils peuvent en caractériser plusieurs centaines par jour.

Les principaux constructeurs de ce type d'appareils sont Perkin Elmer Biosystems (qui a créé en mars dernier un centre de recherche en protéomique), Amersham Pharmacia Biotech, Bruker, et Micromass.

Le principe : une protéine repérée sur le gel d'électrophorèse est découpée en peptides sous l'action d'une enzyme. Le spectromètre mesure les masses de ces peptides, et donne une "carte peptidique massique" qu'il suffit de comparer avec une banque de données pour identifier la protéine. (La société américaine Proteome propose dans ce cadre des banques de protéomes humains, animaux et de micro-organismes).

La méthode est ultra-sensible puisque quelques picomoles suffisent. Mais elle ne fonctionne que pour des protéines déjà répertoriées. Dans le cas contraire, les chercheurs optent pour la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS), qui donne accès aux séquences peptidiques et permet de remonter à la protéine.

Les sociétés d'instrumentation développent en ce moment des solutions de plus en plus complètes dédiées à la protéomique. Le suédois Amersham Pharmacia Biotech propose le système Ettan, qui inclut l'électrophorèse 2D et la spectrométrie de masse Maldi TOF.

De son côté, l'américain Genomic Solutions va compléter son dispositif Investigator Proteomic System (électrophorèse 2D et préparation ultérieure des échantillons) avec un spectromètre Maldi TOF en collaboration avec HD Technologies. Tandis que Bio-Rad (spécialiste de l'électrophorèse 2D) et Micromass (constructeur de spectromètres de masse) ont récemment joint leurs forces pour créer le système ProteomeWorks.

Mais ces techniques montrent déjà leurs limites. En particulier l'électrophorèse 2D, qui sépare mal les protéines peu solubles dans l'eau, comme les protéines membranaires. Or, les récepteurs membranaires sont justement des cibles thérapeutiques très importantes.

La puce capture les protéines
D'où l'intérêt des puces à protéines, inventées par la société californienne Ciphergen. Sa ProteinChip sépare les protéines par affinité : elles viennent se déposer spécifiquement sur des surfaces chimiques (définies par des régions inoniques, hydrophobes, hydrophiles, etc.) ou biochimiques (anticorps, récepteurs, ADN) fixées sur un support. Après lavage, les protéines capturées sont analysées directement sur la puce par spectrométrie de masse.

Au début de l'année, Ciphergen annonçait les premiers résultats de sa ProteinChip : l'identification de douze marqueurs potentiels d'une maladie bénigne de la prostate et six marqueurs du cancer de cet organe. Très peu connue en France, cette technique est pourtant déjà exploitée notamment chez Aventis, BASF, Glaxo Wellcome, Merck, Novartis et par les sociétés de biotechnologies Medigene, Genentech, Amgen...

Un intérêt qui n'a pas échappé à Oxford GlycoSciences, qui développe en ce moment sa puce à protéines (avec Cambridge Antibody Technology et Packard Bioscience). Et, bonne nouvelle, il paraît que la puce à ADN Micam, développée par le CEA, serait tout à fait adaptée à la capture de protéines... Par Michel Le Toullec


Les outils
Comment séparer et identifier les protéines

L'électrophorèse bidimensionnelle
Cette méthode sépare en deux étapes un mélange de protéines en solution. La séparation est réalisée dans une première direction dans un gel à gradient de pH : les protéines sont séparées en fonction de leur point isoélectrique. La deuxième étape est réalisée dans la direction perpendiculaire dans un gel en présence de SDS (sodium dodécyl sulfate) qui sépare les protéines selon leur masse.
La spectrométrie de masse
La protéine repérée sur le gel 2D est digérée par une enzyme, la trypsine. 
Un spectromètre de masse Maldi TOF mesure les masses des peptides obtenus et donne une "carte peptidique massique" de la protéine, qui sera identifiée par comparaison avec le contenu d'une banque de données. Si la protéine n'est pas répertoriée, la spectrométrie de masse en tandem MS/MS prend le relais.

 
 Les puces à protéine
La puce à protéine permet d'identifier des protéines directement à partir d'extraits bruts (sérum...). Les protéines se lient par affinité sur des surfaces chimiques (ioniques, hydrophobes, hydrophiles) ou biochimiques (anticorps, récepteurs, ADN) fixées sur un support. Après lavage, les protéines capturées sont identifiées sur la puce par spectrométrie de masse (selon le procédé Seldi, Surface enhanced laser desorption/ionization).


L'expert
COMMENT DÉVELOPPER L'ANALYSE DU PROTÉOME EN FRANCE
Jérôme Garin, directeur du laboratoire de chimie des protéines (CEA, à Grenoble) coordonne un groupe de travail sur la protéomique. Lors de la création en 1999 du groupe de travail " Analyse du protéome " du club Crin Biotechnologies, Jérôme Garin, directeur du laboratoire de chimie des protéines du CEA, à Grenoble, a constaté le retard de la France dans ce domaine.

Depuis, au sein de ce groupe, des laboratoires de recherche publique (CEA, CNRS, Inserm) de Grenoble, Lille, Paris et Strasbourg côtoient les sociétés Pierre Fabre, Biomérieux, Rhône-Poulenc Rorer, Synthélabo, Transgène, Pharmacia, Hoechst Marion Roussel...

Selon Jérôme Garin, la France possède des atouts qui pourraient lui permettre de renverser la situation. " L'une des limites de la protéomique concerne les protéines peu solubles dans l'eau, comme les protéines membranaires ", explique-t-il. Ces protéines sont souvent perdues au cours de l'électrophorèse 2D. Or, la Génopole Rhône-Alpes possède justement une expertise dans le domaine des protéines hydrophobes, qu'elle compte appliquer à l'étude systématique des protéines membranaires de plusieurs compartiments subcellulaires.

La France est aussi en pointe sur le sujet de la bio-informatique. Un projet regroupe l'Inria (cellule Helix), la société Génome Express et le Laboratoire de chimie des protéines du CEA sur un logiciel dénommé PSTmap. Cet outil permettra d'exploiter le très grand nombre d'informations (séquences, masses) résultant des études protéomiques en les confrontant directement aux séquences génomiques.

UN SITE EXPERT SPÉCIAL PROTÉOMIQUE
L'Institut suisse bio-informatique, à Genève, a créé Expasy (Expert Protein Analysis System), un serveur dédié à la protéomique. L'intéressé pourra y trouver un ensemble d'outils et de services spécifiques : bases de données, systèmes informatiques, formations, documentation... Sans oublier des liens vers d'autres sites européens, japonais et australiens sur ce sujet (www.expasy.ch/).


L'entreprise
COMMENT ÉTUDIER LES INTERACTIONS ENTRE LES PROTÉINES
Créée en 1997, Hybrigenics développe la protéomique fonctionnelle - à savoir la caractérisation des interactions entre protéines - selon une technologie mise au point à l'Institut Pasteur. Elle utilise une collection de protéines "appâts" pour cribler par une technique robotisée à haut débit des banques génomiques, ce qui lui permet de trouver l'ensemble des protéines "proies" d'une cellule. Grâce à des outils bio-informatiques, ses chercheurs déterminent la pertinence des interactions trouvées et les classent selon des critères qualitatifs. Hybrigenics a ainsi construit la Protein Interaction Map (PIM) du micro-organisme Helicobacter pylori, impliqué dans les ulcères. Les PIM permettent d'identifier des cibles thérapeutiques éventuelles.
Recherche sur l'hépatite C et l'obésité Côté partenariats, Hybrigenics travaille avec l'ANRS (Agence nationale de recherche sur le sida) sur la construction d'une carte d'interactions VIH-lymphocyte. Une collaboration est également en cours avec la société californienne Lynx Therapeutics sur le thème de l'obésité. Et depuis la rentrée, Hybrigenics s'est joint à l'entreprise israélienne XTL Biopharmaceuticals dans le but de développer de nouvelles solutions thérapeutiques contre l'hépatite C. Hybrigenics utilisera ses compétences dans le criblage des interactions protéiques, afin de sélectionner des cibles dont la validité sera testée par la société israélienne.

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