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Biopuces - La french connection se met en place (sept 2002)

Puces à ADN, puces à protéines, labos-sur-puce : la filière française de biopuces est née. Son objectif : concevoir des puces plus ciblées et moins coûteuses que les produits actuels, essentiellement américains.


En quelques mois à peine, une douzaine de start-up françaises ont investi le créneau des biopuces et plusieurs d'entre elles annoncent leur premier produit d'ici la fin 2002. À défaut d'être une lame de fond, cette tendance montre au moins une chose : que la France ne sera plus absente de ce marché dominé par les États-Unis avec des sociétés comme Affymetrix, Agilent, Nanogen, etc.

La nouvelle est d'autant meilleure que les biopuces - puces à ADN, puces à protéines et labos-sur-puce - sont sur le point de révolutionner le diagnostic médical et l'analyse biologique en général.

L'atout majeur de ces systèmes est leur capacité à déceler une molécule biologique - dans un échantillon qui peut en contenir des millions - par affinité spécifique avec une sonde moléculaire fixée sur la puce. Ces supports d'analyse miniaturisés (de quelques cm2) sont couplés à un lecteur et à un système de traitement de données bio-informatiques.

Le changement d'échelle lié à cette technologie procure nombre d'avantages : gain de temps, économie de volumes d'échantillons et augmentation très nette des traitements en parallèle et donc de la quantité de données acquises.

Puces à ADN à façon

Parce qu'elles partent avec une longueur de retard, les entreprises françaises ont tout intérêt à miser sur un positionnement différent de celui des pionniers. " Alors que les premières biopuces américaines étaient des produits standards à haute densité, avec plus de 10 000 sondes sur une puce, les produits français ont des formats limités à quelques dizaines ou centaines de sondes ", remarque David Bariau, chargé de mission "biotechnologies" pour la société de conseil Alcimed. "

Mais ces puces se caractérisent par un contenu à forte valeur ajoutée : elles peuvent être conçues sur-mesure et pour un coût abordable, à partir des gènes ciblés par le client. " Les deux premières sociétés françaises de puces à ADN sont nées simultanément en mai 2001 : Apibio à Grenoble et Rosatech à Lyon. Apibio fait cependant figure de pionnière car elle résulte de travaux initiés au CEA au début des années 90. " Nous entamerons en 2003 l'industrialisation de notre puce Micam et son prix sera inférieur à 50 euros ", explique Marc Cuzin, directeur scientifique.

Conçue sur mesure, une puce Micam est constituée d'un support de silicium portant 128 oligonucléotides présynthétisés. Applications : la recherche pharmaceutique, le contrôle agroalimentaire, etc. Dès la fin 2002, la société lancera des puces sur mesure sur substrat plastique, à moins de 5 euros.

Développées avec bioMérieux, actionnaire d'Apibio, ces puces baptisées Olisa porteront 16 sondes (oligos, peptides ou protéines). Autre atout de la société Apibio : sa plate-forme qui inclut un lecteur conçu avec le CEA-Leti pour détecter les hybridations.

La start-up Rosatech est, quant à elle, issue du projet "puces à ADN" Rosa mené par le CNRS entre 1997 et 2001. Son originalité est d'utiliser deux méthodes de production de puce de faible ou moyenne densité. " Nous pratiquons la synthèse directe d'oligonucléotides sur verre ou silicium pour mettre au point une puce unitaire afin de voir comment elle réagit ", explique Éliane Souteyrand, directeur scientifique.

Mais la production de puces en série se fait par adressage localisé de sondes présynthétisées. Les premières puces, livrées en juillet 2002 pour validation chez le client, concernent le diagnostic médical. La benjamine des sociétés françaises de puces à ADN, Genescore, vient tout juste d'éclore en août à Paris.

Conçues à partir des travaux de Marie-Claude Potier à l'ESPCI (Paris), ses puces sont constituées de centaines d'oligonucléotides longs (plus de 50 bases) fixés sur du verre. Les atouts de la technologie : un rapport signal/bruit amélioré et la possibilité d'étudier des gènes faiblement exprimés. " Nous lancerons des puces standards fin 2002 dans deux domaines : la neurostransmission et les facteurs de transcription ", précise Luc Talini, créateur de GeneScore. Qui ajoute : " Des puces à façon seront conçues pour l'étude de maladies spécifiques. Nous proposerons à nos clients un partenaire (Mediagen) pour la bio-informatique et un autre (à définir) pour le lecteur. "

Diagnostic de cancers

D'autres entreprises développent des puces à ADN dans le cadre de leur activité, sans que cela soit leur métier de base. " L'atout de ces sociétés est qu'elles sont très orientées vers les applications ", commente David Bariau chez Alcimed. C'est le cas de Genolife (à Clermont-Ferrand), spécialiste du diagnostic génétique industriel, dont la première puce à ADN vise la détection de pathogènes dans l'eau de consommation et l'eau de baignade : listéria, légionelle, etc. Le lancement est prévu pour le début 2003. Autre exemple : la société marseillaise Ipsogen, spécialiste du profiling des cancers, qui développe des puces pour le diagnostic in vitro. " Nous exploitons une technologie mise au point au Centre d'immunologie de Marseille-Lumigny ", précise Vincent Fert, son PDG. " Le support est un polyamide, dont la surface poreuse permet de fixer dix fois plus de matériel génétique que le verre. "

La première application, un système de diagnostic de la leucémie, est en cours d'essais cliniques. La deuxième concernera le diagnostic du cancer du sein. Exonhit, à Paris, exploite aussi le principe des biopuces pour ses produits dédiés à la pharmacogénomique (la mise au point de médicaments adaptés au profil génétique des patients). Ainsi, le kit Proof-Hit est une puce qui porte des variants d'ARN caractérisant la réponse d'une tumeur à des chimiothérapies. Tandis que son système de toxicité prédictive Safe-Hit porte des séquences d'ADN impliquées dans les mécanismes de défense activés par le gène p53.

Deuxième famille de biopuces, les puces à protéines s'adressent en particulier au secteur de la protéomique. À savoir l'analyse des protéines spécifiques des maladies, comme autant de marqueurs de ces pathologies ou de cibles pour de futurs traitements. Même si leurs formats se ressemblent, les puces à protéines sont très différentes des puces à ADN.

 Leur complexité est plus grande et elles autorisent l'analyse de toute une gamme d'interactions moléculaires (voir schéma) : antigène-anticorps, enzyme-substrat... Les producteurs ne sont d'ailleurs pas les mêmes, à l'exception d'Apibio présent sur les deux créneaux mais avec deux technologies distinctes.

Pronostic d'allergies

C'est ainsi que GenOptics (créée en août 2001 à Orsay) produit par greffage électrochimique des puces à protéines pour le suivi de centaines d'interactions protéine/ligand simultanées. Sa technique de lecture optique ne nécessite par de marquage préalable des échantillons, ce qui évite les problèmes de perturbation biologique et réduit les coûts d'analyse. Ses partenariats concernent l'oncologie et l'allergie.

Avec l'ESPCI, une puce est dédiée au pronostic et au suivi thérapeutique d'allergies communes. Une autre puce est développée avec l'Institut Curie pour l'étude d'interactions ADN/ protéine au cours de la régulation et de la réparation du génome. Pour la synthèse préalable des protéines, GenOptics est en contact avec Protein'Expert à Grenoble.

En cours de création à Nantes, ProtNeteomix maîtrise à la fois la production des protéines et la fabrication des puces. " Nous synthétisons les protéines in vivo ou in vitro ; dans ce dernier cas, les molécules peuvent être produites à haut débit à partir d'ADN linéaire sans étape de clonage dans les cellules ", explique Vehary Sakanyan, créateur de ProtNeteomix. "Nos puces à protéines (standard ou sur mesure) assurent la détection par fluorescence d'interactions moléculaires, à raison de 96 échantillons analysés en 72 heures ". Applications : le criblage de molécules thérapeutiques, le diagnostic et l'analyse du protéome de pathogènes. Des partenariats sont en cours sur le VIH et sur une maladie hépatique.

La société lilloise Sedac Therapeutics travaille sur une puce à peptides pour analyse sanguine. " Brevetée en 2001, cette puce en verre porte quelques centaines de peptides fixées par ligation, explique Hélène Gras-Masse, directeur scientifique. Le principe convient aussi à l'immobilisation de glycoprotéines. " Destinée à la sécurité transfusionnelle, cette puce détecte par fluorescence des anticorps spécifiques dans une goutte de sang, sans étape préalable de séparation.

Labos-sur-puce détecteurs d'OGM

Les laboratoires sur puce représentent la troisième technologie de biopuces. Il s'agit cette fois de véritables "microlabos" de la taille d'une carte de crédit intégrant les fonctions de pompage, mélange, séparation, détection...

Le premier français sur ce créneau est GeneSystems, créée en 2000 près de Rennes : son labo-sur-puce GeneDisc est disponible depuis septembre 2002. C'est un disque au format CD avec six réservoirs centraux (pour recueillir six extraits d'ADN) reliés par un réseau de microcanaux à 42 chambres réactionnelles ou sont prédéposés les "mix-PCR".

Premières applications : la détection de la salmonelle (en 10 heures) et de listeria (en 26 heures) dans le lait, la viande, les plats cuisinés... La détection d'OGM selon le même principe est prévue.

Deux autres entreprises créées en 2001 en sont au stade de développement de leurs labos-sur-puce : Nanobiogene (Besançon) pour le diagnostic médical et Spinelix (Clermont-Ferrand). D'autres start-up pourraient d'ailleurs suivre. Ainsi, un système microfluidique gravé sur silicium a été réalisé à l'université des sciences et techniques de Lille, notamment pour l'analyse protéomique. Au CEA-Leti, une carte mixte silicium/plastique a été conçue avec Genset pour un système de génotypage à haut débit.

Ce support présente une cinquantaine de capillaires : en parcourant un de ces canaux, un échantillon biologique subit une PCR, une purification suivie d'un séquençage et une détection par fluorescence. Enfin, à l'ESPCI, Armand Ajdari développe un micro-mélangeur "chaotique" pour labo-sur-puce.
Michel Le Toullec

TROIS TECHNOLOGIES PROMETTEUSES

1.LES PUCES À ADN :

PRINCIPE
 :
Des oligonucléotides sont fixés sur la puce. Ils s'hybrident avec leurs complémentaires si ceux-ci sont présents dans l'échantillon. Les hybridations sont détectées par procédé optique.
ENJEU :
Diagnostic génétique pour l'agroalimentaire et l'environnement
Test de diagnostic in vitro de cancers
Etude de la réponse de tumeurs à un médicament
Prévision de la toxicité de médicaments en phase de développement
Les start-up à suivre :
Apibio (Marc Cuzin)
Rosatech (Éliane Souteyrand)
Genolife (Franck Chaubron)
Ipsogen (Vincent Fert)
GeneScore (Luc Talini)
ExonHit (Muriel Draoui)

2.LES PUCES À PROTÉINES :
PRINCIPE :
Les protéines immobilisées sur le support se fixent par affinité avec des molécules spécifiques de l'échantillon étudié. Les interactions sont détectées par procédé optique.
ENJEU :
Analyse protéomique comparative et quantitative
Criblage de molécules d'intérêt thérapeutique
Pronostic et suivi thérapeutique de maladies (cancers)
Analyse sanguine pour sécurité transfusionnelle
Les start-up à suivre :
ProtNeteomix (Vehary Sakanyan)
GenOptics (Yves Jacquot)
Sedac Therapeutics (Hélène Gras-Masse)
Apibio (Marc Cuzin)
Spinelix (Mario Caria)

3.LES LABOS-SUR-PUCE :
PRINCIPE :
Les labos-sur-puce sont constitués de microcanaux
(gravés sur un support) connectés et équipés de fonctions pompe, valve, mélangeur et analyseur, elles aussi à l'échelle du micron.
ENJEU :
Détection de germes pathogènes dans les aliments
Préparation d'échantillons protéiques avant leur séparation par spectrométrie de masse
Génotypage à haut débit
Les start-up à suivre :
GeneSystems (Gabriel Festoc)
Nanobiogen (Moussa Hoummady)
Spinelix (Mario Caria)

L'AVIS DE DEUX UTILISATEURS FRANÇAIS LA BIOPUCE DE LEURS RÊVES
François Radvanyi
, directeur de recherche CNRS, Institut Curie (Paris)
Une puce à oligonucléotides sur mesure rapide à construire pour un coût abordable. Son laboratoire utilise depuis un an des puces standards U95 et U133 d'Affymetrix qui coûtent environ 1 000 euros (prix remisé) par puce.
Une puce qui prenne en compte les variants d'épissage. Il faudrait par exemple des sondes oligonucléotides "chevauchant" deux exons.
Une puce composée d'oligonucléotides pour lesquels le facteur de proportionnalité entre le signal mesuré et la quantité d'ARN ne dépende pas du gène étudié.
Une puce qui ne nécessiterait pas d'étape préalable d'amplification de l'ARN de l'échantillon à étudier.
Vladimir Lazar, responsable de l'unité de génomique fonctionnelle, Institut Gustave Roussy (Villejuif)
Une puce à coût modéré : il travaille depuis mai 2002 sur des puces à cDNA standard d'Agilent (environ 1 500 euros pour 24 000 gènes, prix catalogue) et bientôt sur des puces à oligonucléotides à façon.
Une puce dont la fabrication et la manipulation soient totalement reproductibles. Pour comparer des résultats d'un système à un autre, il faudrait aussi prévoir des échantillons références standards.
Une puce au protocole d'utilisation simplifié et dont le traitement bio-informatique soit accessible pour des chercheurs ou médecins et pas seulement pour des spécialistes.
Une puce compatible avec l'automatisation du processus et dont la traçabilité soit assurée par codes-barres.

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